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【摘要】

作為生物材料的重要組成部分，膠原蛋白為組織工程中的細(xì)胞粘附和增殖提供了三維支架和生物學(xué)線索。最初在化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)并在異源宿主中產(chǎn)生的重組膠原蛋白樣蛋白已被化學(xué)和基因工程改造用于生物材料應(yīng)用。然而，現(xiàn)有的類膠原蛋白不形成凝膠，限制了它們作為生物材料的實(shí)用性。

最近，江南大學(xué)許菲教授團(tuán)隊(duì)提出了一系列合理設(shè)計(jì)的類膠原蛋白，由三聚化結(jié)構(gòu)域、不同長度的三螺旋結(jié)構(gòu)域和一對(duì)作為粘合末端連接到 N 和 C 末端的異源三聚體卷曲螺旋序列組成。這些設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)折疊成三重螺旋并形成自支撐凝膠。隨著三螺旋域的延長，凝膠變得不那么硬，孔徑增加，結(jié)構(gòu)各向異性降低。此外，細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)是無細(xì)胞毒性的。這項(xiàng)研究為基于膠原蛋白的生物材料提供了一種設(shè)計(jì)策略。序列變化揭示了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和材料特性之間的關(guān)系，其中交聯(lián)密度和結(jié)合能的變化定義了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的凝膠化。相關(guān)論文以題為Design Strategies to Tune the Structural and Mechanical Properties of Synthetic Collagen Hydrogels發(fā)表在《生物大分子》上。

圖 1. 蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)策略和驗(yàn)證。測(cè)試了三種設(shè)計(jì)：E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3。蛋白質(zhì)的 (A) 序列和 (B) 二級(jí)結(jié)構(gòu)的示意圖。(C) 提出的分子間關(guān)聯(lián)和自組裝機(jī)制。凝膠電泳表征 (D) 用 NcoI 和 BamHI 酶消化重組質(zhì)粒后核苷酸片段的長度和 (E) 蛋白質(zhì)的分子量。(F-I) 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間 (MALDI-TOF) 質(zhì)譜法表征蛋白質(zhì)的分子量。

圖 2. 凝膠結(jié)構(gòu)。(A-D) E3-VB-K3 的凝膠化通過倒置小瓶和鑷子操作來測(cè)試。凍干后，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)被切成 (B, C) 縱向和 (D) 橫截面，并用掃描電子顯微鏡 (SEM) 觀察。(E-H) E3-VBB-K3 的小瓶倒置測(cè)試和 SEM，具有 (F, G) 縱向和 (H) 橫截面，以及 (I-L) E3-VBBB-K3，具有 (J, K) 縱向和 (L) 橫向橫截面。由于 E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 凝膠的硬度低，它們不能用鑷子處理。

圖 3. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。(A) CD 波長掃描和 (B) VB、E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 在 10 mM 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中 1 mg/mL 的熱變性曲線。

圖 4. 10 mM 中濃度為 10 mg/mL 的設(shè)計(jì)膠原蛋白 (A) VB、(B) E3-VB-K3、(C) E3-VBB-K3 和 (D) E3-VBBB-K3 的差示掃描量熱法 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。

圖 5. 粒度分布。設(shè)計(jì)的膠原蛋白 (A) VB、(B) E3-VB-K3、(C) E3-VBB-K3 和 (D) E3-VBBB-的流體動(dòng)力學(xué)半徑(Rh)分布的動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 測(cè)量 K3 超過 48 小時(shí)。將樣品在 10 mM 磷酸鹽緩沖液中保持在 4 °C，濃度約為 1 mg/mL（pH 7.4）。每個(gè)子圖的插圖顯示主要 Rh 峰（> 5% 體積強(qiáng)度）隨時(shí)間的變化。在所有子圖中，不同時(shí)間的R_h分布曲線如右圖所示。

圖 6. 微流變學(xué)。(A, D) E3-VB-K3、(B, E) E3-VBB-K3 和 (C, F) E3-VBBB-K3 蛋白質(zhì)溶液在 0.5 時(shí)的儲(chǔ)存和損失模量 G 和 G  和 1.6% (w/v) 在 10 mM 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中。頂行顯示濃度為 0.5%，底行顯示濃度為 1.6% (w/v)，但 E3-VBBB-K3 (F) 顯示為 1.16% (w/v) 的飽和濃度。

圖 7. 細(xì)胞在涂有設(shè)計(jì)膠原蛋白的板上鋪展。將 NIH/3T3 小鼠成纖維細(xì)胞接種并鋪展在涂有天然 I 型膠原蛋白（陽性對(duì)照）、VB、E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 的組織培養(yǎng)板上，濃度為 1 、10 和 40 μg/mL，持續(xù) 24 小時(shí)。蛋白質(zhì)名稱和濃度分別標(biāo)記在圖的左側(cè)和頂部。細(xì)胞用 CFDA SE 和 Hoechst 染色，并用熒光顯微鏡觀察。比例尺代表所有圖像中的 100 μm。

圖 8. 由不同 (A) 濃度和 (B) 培養(yǎng)時(shí)間的設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)組成的底物上的相對(duì)細(xì)胞活力。樣品名稱標(biāo)在右側(cè)。測(cè)試天然 I 型膠原蛋白（黑色）作為陽性對(duì)照。

團(tuán)隊(duì)開發(fā)了通過蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)自組織成凝膠的重組膠原蛋白。膠原蛋白使用連接到 Scl2 片段的 α-螺旋粘性末端的嵌合體，重組表達(dá)使蛋白質(zhì)材料的大規(guī)模和低成本生產(chǎn)成為可能。這些設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然膠原蛋白相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即批次間的一致性、易于遺傳操作，以及可用于承載賦予生物功能（如整合素結(jié)合）的序列的模塊化設(shè)計(jì)。細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)凝膠無細(xì)胞毒性，使其可用于三維細(xì)胞培養(yǎng)。
細(xì)胞環(huán)境的結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性影響細(xì)胞活力和命運(yùn)。通過修改蛋白質(zhì)一級(jí)序列，團(tuán)隊(duì)可以在嵌合設(shè)計(jì)中調(diào)整材料特性，例如孔徑、微觀結(jié)構(gòu)的各向異性、凝膠強(qiáng)度和含水量。 E3-VB-K3 形成具有各向異性微觀結(jié)構(gòu)的硬凝膠，由均勻的小孔組成。E3-VBBB-K3 形成了均勻的水凝膠，具有更多的多孔微結(jié)構(gòu)和高 (> 98%) 的水含量。此外，觀察到的各向異性微結(jié)構(gòu)通常與由分子間相互作用和外力（如磁場(chǎng)和機(jī)械拉伸）誘導(dǎo)的聚合物的順序組裝過程有關(guān)。團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的具有加長三螺旋結(jié)構(gòu)域的膠原蛋白似乎可以提高碰撞概率、加速組裝過程并破壞分子的單軸取向。在 DLS 中，E3-VB-K3 隨著時(shí)間的推移形成穩(wěn)定的小顆粒和中等尺寸（~60 和~500 nm），而 E3-VBBB-K3 的粒徑增加，范圍從~300 到~3000 nm。

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